Thứ Sáu, 22/02/2019 | 09:32

Vì tyrosinase xúc tác tổng hợp melanin, chất ức chế tyrosinase rất quan trọng trong làm trắng da mỹ phẩm. Ức chế oxy hóa góp phầnlão hóa da và có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của da, điều đó có nghĩa là chất chống oxy hóa hoạt động trong tế bào da có thể hỗ trợ sức khỏe của da. Một nhóm các nhà nghiên cứu đã thử nghiệm 25thuốc thảo dược truyền thống của Trung Quốc có thể hữu ích cho việc làm trắng da và sức khỏe của da. Bài viết dưới đây trân trọng giới thiệu đến quý độc giả một vài kết quả của nghiên cứu này.

Sự hình thành melanin là yếu tố quan trọng nhất quyết định màu da. Melanin được tổng hợp theo một lộ trình sinh hóa gồm nhiều bước, hoạt động trong một cơ quan nội bào chuyên biệt, hạt melanin. Giai đoạn kích hoạt tyrosinase một enzyme của tế bào sắc tố, nguyên nhân “đánh thức” tyrosinase có thể là: tia UV, hooc-mon, stress…

Quy trình sản xuất melanin

Sau khi tyrosinase được kích hoạt, giai đoạn tổng hợp melanin được thực hiện trong một cơ quan của tế bào sắc tố gọi là melanosome. Giai đoạn tổng hợp melanin bao gồm 3 phản ứng hóa học. Phản ứng đầu tiên là enzyme tysorinase chuyển một acid amin là tysosine thành DOPA.Phản ứng hóa học thứ hai là chuyển DOPA thành dopaquinone.Phản ứng hóa học thứ 3 là chuyển dopaquinone thành một trong 2 dạng melanin tùy theo màu da của chủng tộc là: Pheo-melanin hay EU-melanin.

Sau khi thực hiện xong việc tổng hợp melanin trong các túi melanosome, tế bào melanocyte chuyển giao các “bưu kiện” melanosome đã “ đóng gói” melanin cho tế bào keratinocyte đưa lên lớp biểu bì của da và kết thúc cuộc hành trình tạo melanin..

Nếu các gốc tự do được xử lý không phù hợp trong quá trình tổng hợp melanin, hydro peroxide (H2O2) được tạo ra, dẫn đến việc sản xuất các gốc hydroxyl (HO • -) và các loại oxy phản ứng khác (ROS). Sinh tổng hợp melanin có thể bị ức chế bằng cách tránh tiếp xúc với tia cực tím (UV), bằng cách ức chế chuyển hóa và tăng sinh melanocyte, bằng cách ức chế tyrosinase hoặc loại bỏ melanin bằng cách cắt bỏ giác mạc. Ngoài việc tránh tiếp xúc với tia cực tím, việc sử dụng các chất ức chế tyrosinase có thể là quy trình ít xâm lấn nhất để duy trì độ trắng của da.C ác tác nhân như vậy ngày càng được sử dụng trong các sản phẩm mỹ phẩm.

            Ức chế oxy hóa có thể được gây ra bằng cách tăng thế hệ ROS và các gốc tự do khác. Bức xạ tia cực tím có thể tạo ra ROS trong da như oxy nhóm đơn và anion siêu oxit, thúc đẩy thiệt hại sinh học ở các mô tiếp xúc thông qua các phản ứng oxy hóa được xúc tác sắt. Những ROS này tăng cường sinh tổng hợp melanin, phá hủy DNA và có thể gây ra sự tăng sinh của melanocytes. Một nghiên cứu trước đây cũng tìm thấy bằng chứng cho vai trò của ức chế oxy hóa trong sinh bệnh học của các trật tự da. Các chất tẩy hoặc chất ức chế ROS như chất chống oxy hóa có thể làm giảm sắc tố.

            Các loại thuốc thảo dược truyền thống cung cấp một nguồn thú vị, phần lớn chưa được khám phá để phát triển các loại thuốc mới tiềm năng. Tiềm năng ứng dụng của các loại thuốc thảo dược truyền thống để phát triển mỹ phẩm chăm sóc da mới đã được nhấn mạnh gần đây. Việc các chế phẩm được sử dụng trong ngành y học dân gian có thể hữu ích trong các công thức hiện đại hay không đang được quan tâm lớn. Trong nghiên cứu hiện nay, tác dụng chống tyroxinaza của chiết xuất ethanol 95% của một số loại thuốc thảo dược truyền thống của Trung Quốc được sử dụng để chăm sóc da trong sách cổ đã được đánh giá trong nuôi cấy tế bào melanocytes ở người. Khả năng chống oxy hóa và nội dung phenolic của chúng cũng đã được thử nghiệm.

Ảnh minh họa. Nguồn Internet

Nguyên liệu và phương pháp

Thuốc thử

Triton X-100, l-3,4-dihydroxyphenylalanine (l-DOPA), natri hydroxit (NaOH), luminol, melanin, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 3- (4,5-dimethyl- thiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), ethylenediaminete-traacetic acid (EDTA) và thuốc thử folinedom ciocalteu được tinh chế từ sigma (St. Louis, MO). Các hóa chất khác thuộc loại cao cấp nhất có sẵn trên thị trường.

Chuẩn bị chiết xuất

Thuốc thảo dược khô truyền thống của Trung Quốc được nghiền thành bột trong máy xay và chiết bằng dung dịch ethanol 95% 10 lần ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày và sau đó được lọc. Quy trình được lặp lại hai lần. Các sản phẩm tách lọc được kết hợp và được cô đặc dưới áp suất giảm, đông khô và được bảo quản trong hộp kín cho đến khi sử dụng

Nuôi cấy tế bào

            Nuôi cấy sơ cấp tế bào sắc tố biểu bì bình thường ở người (HEMn, Cat. C-102-5C, Cascade Biologics, Inc., portland, OR) có nguồn gốc từ bao quy đầu sơ sinh được mua từ Công ty Cascade Biologics. Chúng được cấy ở trung bình 254 (Cat. M-254-500, Cascade Biologics) được tiếp thêm chất bổ sung tăng trưởng melanocyte ở người (HMGS, Cat. S-002-5, Cas-cade Biologics).

Xét nghiệm khả năng sống của tế bào

            Khả năng tồn tại của tế bào được xác định bằng phương pháp MTT. Đối với các thử nghiệm, các tế bào được mạ trong các tấm 24 giếng ở mức 1 × 105 tế bào / giếng. Sau 24 giờ, mẫu thử được thêm vào từng giếng và được ủ trong 24 giờ. Sự sống sót của tế bào được xác định trong thử nghiệm so màu sử dụng hoạt động enzyme khử hydrogen của ty thể trong ty thể hoạt động để tạo thành formazan màu tím. Độ xuyên qua tế bào được tính như sau: khả năng sống của tế bào (%) = (độ hấp thụ của mẫu thử / độ hấp thụ của môi trường chỉ) × 100

Xét nghiệm hoạt động tyroxinaza của tế bào

            Hoạt tính tyrosinase được đo như mô tả trước đây, với sự điều chỉnh nhẹ. Nói tóm, lại các tế bào melanocyte bình thường của con người được nuôi cấy trong các đĩa 24 giếng. Sau khi được điều trị bằng một chế phẩm thảo dược riêng trong 24 giờ, các tế bào được rửa bằng dung dịch muối kali phosphate (PBS) và được lọc bằng PBS (pH 6,8) chứa 1% triton X- 100. Sau đó, các tế bào bị phá vỡ do đóng băng và tan băng, và hợp chất dung giải tế bào được xử lý bằng cách ly tâm ở 10.000 × g trong 10 phút. Hàm lượng protein được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.) sau khi định lượng nồng độ protein và điều chỉnh nồng độ với dung dịch đệm cho đến khi mỗi hợp chất dung giải tế bào chứa cùng một lượng protein (40 g). Mỗi giếng của một đĩa 96 giếng chứa 40 g protein, 2,5 mM l-DOPA và 0,1 M PBS (pH 6,8). Sau khi ủ ở 37 ◦C trong 1 giờ, độ hấp thụ (dưới dạng mật độ quang, OD) được đo ở 450nm bằng đầu đọc ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết enzyme).

Đo hàm lượng melanin trong melanocytes

            Hàm lượng melanin được đo như mô tả trước đây, với sự điều chỉnh nhẹ. Các tế bào được điều trị bằng các chế phẩm riêng lẻ được thử nghiệm trong 24 giờ. Tế bào cho phép đã được hòa tan trong NaOH 1N ở 37 C qua đêm và được tách ra trong 10 phút ở 10.000 × g. Mật độ quang (OD) của mỗi chất nổi trên bề mặt được đo ở 450nm bằng đầu đọc ELISA

Xét nghiệm cho hoạt động tinh luyện 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) trong ống nghiệm

            Mỗi chế phẩm thử nghiệm riêng lẻ trải qua phản ứng với 160 M DPPH trong dung dịch metanol. Sau khi ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối, độ hấp thụ được đọc ở 517nm.

Xét nghiệm cho hoạt động quét gốc hydroxyl trong ống nghiệm

            Các gốc hydroxyl được tạo ra bởi phản ứng fenton bằng phương pháp phát quang như được sửa đổi. Hỗn hợp phản ứng chứa 40 M luminol, đệm phosphate 4,17 mM (pH 7,5), sắt 4,6 M (III) – ED M 2,3 M, chuẩn bị thử nghiệm, và H 2 O 2 mM. Phản ứng hóa học-cent được tiến hành trong dung dịch đệm NaOH KH2PO4â € (pH 7,5) ở nhiệt độ phòng. Bắt đầu phản ứng đã đạt được bằng cách thêm Fe (III) – EDTA và sau đó là H 2 O 2 vào hỗn hợp. Cường độ phát quang được theo dõi trong phạm vi bước sóng 200 – 900 900nm.

Xác định tổng hàm lượng phenolic

            Tổng hàm lượng phenol của mỗi chiết xuất được xác định bằng phương pháp folinedom ciocalteu có thể sửa đổi. Dung dịch mẫu (50 L) được trộn với thể tích bằng 1N thuốc thử folinifer ciocalteu của thuốc thử 20% natri cacbonat (Na2CO3). Sau thời gian ủ 25 phút ở nhiệt độ phòng, hỗn hợp phản ứng được ly tâm ở 5000 vòng / phút trong 10 phút. Chất nổi trên bề mặt được đo ở bước sóng 730nm bằng máy đo nhiệt độ kế. Tổng hàm lượng phenolic được biểu thị dưới dạng tương đương axit gallic (GAE) tính bằng miligam trên gam (mg / g) chiết xuất thực vật khô.

Các dược thảo thường được sử dụng cho mỹ phẩm chăm sóc da

STT Họ thực vật Tên khoa học Bộ phận cây được dùng Mã mẫu
1 Họ Mộc hương nam Asarum heterotropoides Fr. Schumidt Toàn bộ cây M128
2 Họ Mồ hôi var. mandshuricum (maxim.) kitag Lithospermum erythrorhizon sieb. Et Rễ cây M103  
3 Họ Bìm bìm Zucc.Pharbitis nil (L.) choisy Hạt M94
4 Họ Bầu bí Trichosanthes kirillowii maxim. Rễ cây M154
5 Họ Long đởm Gentiana macrophylla pall. Rễ cây M91
6 Họ bạc hà Elsholtzia ciliate (Thunb.) hyland Toàn bộ cây M101
7 Họ bạc hà Leonurus heterophyllus sweet Toàn bộ cây M126
8 Họ bạc hà Agastache rugosa (Fisch. et Mey) Toàn bộ cây M129
9 Họ bạc hà Prunella vulgaris L. Cây oải hương M97
10 Họ đậu Astragalus membranaceus (fisch.) Rễ cây M25
11 Họ đậu Glycyrrhiza uralensis fisch. Rễ cây, thân rễ M21
12 Họ đậu Sophora japonica L. Hoa M108
13 Họ đậu Spatholobus suberectus dunn Thân cây M99
14 Họ loa kèn Polygonatum odoratum (Mill.) Druce Thân rễ M123
15 Họ dâu tằm Cannabis sativa L. Hạt M127
16 Họ dâu tằm Morus alba L. M100
17 Họ cỏ lết Phytolaacca acinosa roxb Rễ cây M106
18 Họ mao lương Paeonia suffruticosa andr. Rễ cây-vỏ cây M109
19 Họ hoa hồng Crataegus pinnatifida bge. var. major N. E. Br Quả M93
20 Họ hoa hồng Prunus persica (L.) batsch Hạt M124
21 Họ cam chanh Citrus reticulata blanco Vỏ hạt M89
22 Họ cam chanh Dictamnus dasycarpus turcz Rễ cây-vỏ cây M125
23 Họ giấp cá Houttuynia cordata thunb Toàn bộ cây M92
24 Họ nho Ampelopsis japonica (Thunb.) makino Rễ cây M102
25 Họ gừng Amornurn villosurn lour Củ M105

Kết quả và thảo luận

            Trong các bài báo trước đây, việc ức chế tyrosinase bằng nhiều hợp chất đã được nghiên cứu, với kết quả là một số chất ức chế hiện được sử dụng làm phụ gia mỹ phẩm hoặc làm sản phẩm chữa bệnh nám da. Gần đây, nhu cầu các chất tự nhiên như các sản phẩm thực vật xanh trong thị trường toàn cầu gia tăng cho mục đích làm mờ da, thẩm mỹ và làm sáng da. Thuốc thảo dược truyền thống của Trung Quốc đã được sử dụng trong thực hành lâm sàng trong nhiều thế kỷ.Chúng thường được sử dụng để duy trì sức khỏe tốt hoặc được sử dụng để điều trị các bệnh khác nhau. Trong nghiên cứu hiện tại, các tài liệu này đã được lựa chọn dựa trên dữ liệu dân tộc học tổng hợp cho thấy, các tác nhân thường được sử dụng lâm sàng như các ứng dụng cho da (Bảng trên). Do đó, chúng tôi đã đánh giá tác dụng của chúBg đối với hàm lượng tyrosinase và melanin trong tế bào melanocytes da người, HEMn, cũng như các hoạt động chống oxy hóa của chúng. 25 loại thuốc thảo dược truyền thống của Trung Quốc được lựa chọn đã được chiết xuất với 95% ethanol, với năng suất chiết xuất dao động từ 2,1 đến 33,5%.

            Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã sử dụng melanocytes da người như một mô hình trong ống nghiệm, vì cần phải đo hiệu ứng độc tế bào. Một xét nghiệm MTT về độc tính tế bào đã được sử dụng trước khi thử nghiệm trong ống nghiệm trên tế bào melanocytes da được thực hiện để kiểm tra sự ức chế tyrosinase và hàm lượng melanin. Trong số 25 chất chiết xuất được thử nghiệm, 12 loại chiết xuất, litosospermum erythrorhizon (M103), pharbitis nil (M94), gentiana macrophylla (M91), glycyrrhiza uralen-sis (M21), sophora jap (M123), cannabis sativa (M127), morus alba (M100), phytolaacca acinosa (M106), cit-rus reticulata (M89), và amornurn villosurn (M105), cho thấy khả năng gây độc tế bào tương đối thấp hơn với tỷ lệ tế bào trên 80 nồng độ 100 g / mL. Sau khi độc tính tế bào thấp được xác định là thử nghiệm đầu tiên về tính hữu ích lâm sàng, 12 chiết xuất thích hợp đã được kiểm tra thêm về sự ức chế hoạt động tyrosinase và hàm lượng melanin.

            Các chất ức chế tyrosinase là thành phần quan trọng của mỹ phẩm và các chất làm sáng da. Chúng tôi đã sử dụng l-DOPA làm chất nền để phát hiện bất kỳ tác dụng ức chế tyroxinaza nào trong các tế bào HEMn (hàm lượng protein trên mỗi giếng, 40 g). Trong số các chất chiết xuất, phar-bitis nil (M94), sophora japonica (M108), spatholobus suberec-tus (M99) và morus alba (M100) cho thấy, tác dụng ức chế tyrosinase mạnh. Giá trị IC50 của chúng lần lượt là 24,9, 95,6, 83,9 và 78,3 g / mL. So sánh, arbutin, một loại mỹ phẩm tự nhiên và chất làm trắng có hoạt tính ức chế tyrosinase, có giá trị IC50 là 3.0 mM trong các tế bào HEMn. Do đó, chất chiết xuất được thử nghiệm của chúng tôi thể hiện hoạt động ức chế lớn hơn arbutin.

            Trong nghiên cứu hiện tại, melanocytes người bình thường đã được sử dụng để xác định hiệu ứng chiết xuất và hàm lượng melanin của tế bào. Các chất chiết xuất chống tyrosinase hoạt động mạnh nhất, pharbitis nil (M94), sophora japonica (M108), spatholobus suberectus (M99) và morus alba (M100), không cho thấy sự ức chế phụ thuộc liều của melanin. Các chiết xuất của phy-tolaacca acinosa (M106) và citrus reticulata (M89) cho thấy, ít hoạt động ức chế tyrosinase và hàm lượng melanin của tế bào thực sự được tăng cường. Do đó, trong nghiên cứu hiện nay, sự ức chế tổng hợp melanin không liên quan đến mức độ ức chế tyrosinase. Sự phát triển này có thể là do thực tế là melanin được tổng hợp theo con đường gồm nhiều bước. Ngoài tyrosinase, quá trình tổng hợp cũng được kiểm soát bởi các enzyme khác như 5,6-dihydroxyindole- 2-carboxylic acidasease (DHICA oxidease) và dopachrom tautomerase (DCT).

DPPH là một gốc ổn định được sử dụng trong một phương pháp phổ biến để sàng lọc khả năng nhặt gốc tự do của các hợp chất hoặc hoạt động chống oxy hóa của chiết xuất thực vật. Các chất chiết xuất từ litvaos-mum erythrorhizon (M103), prunella vulgaris (M97), sophora japonica (M108), spatholobus suberectus (M99) và paeonia achrnomosa (M109) cho thấy, phản ứng của thuốc đối kháng các giá trị IC50 đã được tính. Kết quả chỉ ra rằng, các chiết xuất hoạt động này có thể chứa các thành phần có khả năng hiến proton mạnh (Sawai và Moon, 2000).

            Các gốc hydroxyl là một trong những gốc phản ứng mạnh nhất được tạo ra từ các phân tử sinh học và có thể làm hỏng các tế bào sống Một số chiết xuất thực vật có khả năng làm sạch các gốc hydroxyl và có thể bảo vệ lipid tế bào chống lại các phản ứng gốc tự do như asarum heterotropoides var. mandshuricum (M128), lithospermum erythrorhizon (M103), litospermum erythrorhizon (M103), elsholtzia cili-ate (M01), eluroltzia cili-ate (sativa (M127), morus alba (M100), paeonia achrnomosa (M109), houttuynia cordata (M92) và amornurn villosurn (M105) có thể ức chế hiệu quả sự hình thành của • OH theo cách phụ thuộc nồng độ. Các giá trị IC50 thấp hơn 5 g / mL.

            Trong các nghiên cứu dịch tễ học hiện nay, phenolics đã được tìm thấy là một trong những nhóm thành phần phong phú nhất trong vương quốc thực vật và chúng đã được báo cáo là có nhiều tác dụng sinh học. Các bài báo trước đây cũng đã lưu ý rằng, nhiều hợp chất phenolic có trong thực vật có hoạt tính ức chế tyrosinase. Do đó, chúng tôi đã sử dụng phương pháp folinTHER ciocalteu để xác định tổng hàm lượng phenol của 25 chiết xuất. Kết quả cho thấy, nói chung, các hoạt động ức chế chất chống oxy hóa và tyrosinase của các chất chiết xuất này càng mạnh thì hàm lượng phenolic càng cao. Do đó, phenolics có trong chiết xuất có thể đóng vai trò chính trong việc tạo ra kết quả mà chúng tôi thu được với các nghiên cứu hiện tại. Cũng có báo cáo rằng, các hợp chất phenolic có thể được sử dụng làm tác nhân khử trùng vì chúng có cấu trúc hóa học tương tự với với tyrosine, chất nền của tyrosinase.

            Với tất cả các thử nghiệm được thực hiện cùng nhau, chúng tôi thấy rằng pharbitis nil (M94), sophora japonica (M108), spatholobus suberec-tus (M99) và morus alba (M100) có khả năng gây độc tế bào thấp, khả năng ức chế độc tố thấp chất melanin di động. Chúng cũng sở hữu hàm lượng phenolic cao hơn và các hoạt động nhặt rác gốc hydroxyl tốt, ngoại trừ pharbitis nil (M94). Trong các bài báo trước đây, các hợp chất phenolic đã được báo cáo là có hoạt tính ức chế tyrosinase và đã được nghiên cứu như các tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, các chất chống oxy hóa có thể ngăn ngừa hoặc trì hoãn việc điều trị bằng các cơ chế khác nhau, chẳng hạn như bằng cách tinh luyện ROS và các loài nitơ phản ứng (RNS), hoặc bằng cách giảm o-quinone hoặc các chất trung gian khác trong sinh tổng hợp melanin, do đó trì hoãn quá trình trùng hợp oxy hóa. Chất chống oxy hóa-tocopherol thường được coi là có tác dụng ức chế trùng hợp oxida-tive của phenylalanine như DOPA trong quá trình hình thành melanin. Do đó, tiềm năng của các chất được sử dụng làm chất làm trắng trong các sản phẩm chăm sóc da có thể ít nhất một phần là do các thành phần phenolic.

            Mặc dù một số bài báo đã nghiên cứu tác dụng và thành phần của thuốc thảo dược truyền thống Trung Quốc, pharbitis nil (M94), sophora japon-ica (M108), spatholobus suberectus (M99), và morus alba (M100), một số bài báo đã báo cáo rằng các loại thuốc thảo dược Trung Quốc này có hoạt tính ức chế tyrosinase. Chỉ morus alba (M100) đã được báo cáo cho thấy sự ức chế tyrosinase của nấm trong ống nghiệm và tác dụng ức chế hoạt động tyrosinase và hình thành melanin trong các tế bào u ác tính B-16 và tế bào melana. Thuốc thảo dược này đã được sử dụng như một chất phụ gia mỹ phẩm để làm trắng da.

Kết luận

            Trong nghiên cứu hiện tại, 25 loại thuốc thảo dược Trung Quốc được lựa chọn đã được nghiên cứu về hiệu quả tiềm năng như các chất làm trắng da và duy trì sức khỏe của da. Chiết xuất của bốn chế phẩm thảo dược đã được chứng minh là chất ức chế tổng hợp tyrosinase và melanin mạnh trong các tế bào melanocyte da người. Ngoài các chất chiết xuất từ morus alba (M100), hiện đang được sử dụng làm phụ gia mỹ phẩm, kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng, các chất chiết xuất của pharbitis nil (M94), sophora japonica (M108) và spatholobus suberectus (M99) hữu ích cho các ứng dụng và sản phẩm mỹ phẩm. Các thành phần biệt lập được hướng dẫn sinh học của chúng có thể chứng minh được giá trị đáng kể là phụ gia mỹ phẩm trong tương lai.

Yhocvn.net/Nguồn Tạp chí Journal of Ethnopharmacology

Chưa có bình luận.

Tin khác
Chúng tôi trên Facebook